尊龙凯时人生就博提供了一种有效的CaCl2法，用于制备大肠杆菌的感受态细胞，以便于后续的基因转化实验。

目的

学会利用CaCl2方法制备大肠杆菌感受态细胞，增强细胞对外源DNA的吸收能力。

原理

细菌在0℃的CaCl2低渗溶液中会膨胀成球形，这一过程伴随部分膜蛋白的损失，导致细胞变得易于吸收外源DNA，从而实现转化。

器材

实验所需的器材包括：旋涡混合器、微量移液取样器、移液器吸头、50ml微量离心管、15ml微量离心管、双面微量离心管架、台式冷冻离心机、制冰机、恒温摇床、分光光度计、超净工作台、恒温培养箱、摇菌试管和三角烧瓶等。

试剂

所需试剂包括：E. coli XL1-Blue菌株、LB培养基、0.1 mol/L CaCl2溶液和无菌ddH2O。

实验准备

在开始实验之前，需要进行以下准备：将15ml离心管放入铝制饭盒中灭菌，移液器吸头装入相应的吸头盒中进行灭菌，平板培养基、LB培养基和冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液也需灭菌，同时确保摇菌试管和三角烧瓶的灭菌处理。

操作步骤

1. 在超净工作台中，取一支无菌摇菌试管，加入2ml LB（不含抗生素）培养基。

2. 自超低温冰柜中取出XL1-Blue菌株，放在冰上。在超净工作台中，用烧红的接种环插入冻菌中，然后接入含2ml LB培养基的试管中，置于37℃摇床培养过夜。

3. 从培养液中取0.5ml菌液，转接到含有50ml LB培养基的三角烧瓶中，于37℃、250 r/min的摇床上培养2~3小时，测定OD600为0.375（确保在0.4~0.6之间，细胞数需小于10^8/ml，这是关键参数）。

4. 将培养后的菌液分装到15ml预冷无菌聚丙烯离心管中，放在冰上静置10分钟，然后以4℃、5000 rpm离心10分钟。

5. 倒置离心管以去除上清液，加入1ml冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混均匀，并置于冰上放置30分钟。

6. 再次以4℃、5000 rpm离心10分钟，弃去上清液后，用1ml冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液重新悬浮细胞，置于冰上放置30分钟。

7. 继续以4℃、5000 rpm离心10分钟，弃去上清液后，用200μl冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液悬浮细胞，并在超净工作台中分装至15ml离心管中。此细胞可直接用于转化实验，或立即存放于-80℃超低温冰柜中以备后续使用，保存可达数月。

8. 实验结束后，要在被细菌污染的工作台面上喷洒70%乙醇，确保工作环境的卫生与安全。

尊龙凯时人生就博始终致力于为科研人员提供高效可靠的实验指导与支持，助力生物医学领域的发展。